-
Konfokalt mikroskop hänvisar till ett slags speciellt optiskt mikroskop som kan spela in optiska skivor.
Genom att belysa och observera en enda diffraktionsgränspunkt realiseras optisk skivning i ett laserkonfokalt system. Detta kräver att de två strålsegmenten har samma fokus, så att de är "konfokala". I motsats till bredfältbilder har konfokala bilder ingen defokuserande oskärpa. Detta är en fördel i sig, eftersom den djupa bilden av provet är tydlig och rik på detaljer. Den viktigaste fördelen är emellertid dess tredimensionella visualiseringspotential med mikroskopiska funktioner. När bildsekvensen har förvärvats längs Z-stacken, rekonstrueras och visas 3D-objektet av datorn.
- Konfokal belysning
Punktljuskällans belysning realiseras genom att fokusera ljuskällan på en liten bländare (pinhole) och sedan fokusera den på provet. När öppningen är tillräckligt liten är belysningspunkten endast begränsad av diffraktion, inte av de geometriska parametrarna för ljuskälla och bländare. Vanlig ljuskälla är en stor ytljuskälla, så det är omöjligt att fokusera den på diffraktionsgränsplatsen. Även om transmittansen är mycket låg, är denna typ av fokuserat belysningsljus fortfarande mycket nödvändig (för traditionella ljuskällor).
Bild 1: Belysning för konfokal avbildning. Ljuset från ljuskällan (LS) är inriktad på belysningsstiftet (PI) och kommer sedan in i provet S ..
Laser som ljuskälla har mycket hög kollimation (ljuset i en bra laser är "extremt parallell"). Därför kan lasern fokuseras på en diffraktionsbegränsad plats genom en enda lins utan att använda ett nålhål. Därför har de flesta konfokala mikroskop inget belysningshål. Kvaliteten på ljusfläcken beror på strålkvaliteten på lasern. Om kvaliteten inte är bra kan du också sätta in belysningshålet. Lasern är vanligtvis kopplad till det konfokala mikroskopet genom optisk fiber. Dessa fibrer fungerar också som nålhål.
Laserens fokalisering och hög energitäthet gör det till en idealisk ljuskälla för konfokalt mikroskop. Laserkoherens är inte ett obligatoriskt inslag i konfokal prestanda. Tvärtom, det är en utmaning för optiska designers, eftersom det kommer att orsaka falska interferensmönster, så noggranna designstrategier behövs.
Dessutom har det faktum att den traditionella lasern bara avger en enda färg (laser- "linje") sina egna begränsningar. Vid multifluorescensavbildning och mätning behövs komplexa multilaserarrangemang. Vit laser löser skickligt problemet med flerfärgad avbildning.
Bild 2: Jämförelse av konfokal (höger area) och icke-konfokal avbildning. I Feulgen färgad mus trofoblast. Mycket information om icke-konfokala bilder kommer inte från fokalplan. Konfokal optik eliminerar alla fuzzy faktorer och gör strukturen tydlig.
Konfokal detektion
De flesta detektorer har ett ganska stort känsligt område (fotomultiplikatorrör är vanligtvis flera kvadratcentimeter). Konfokal optik behöver avkänning. Därför är det nödvändigt att utföra spotdetektering genom att infoga en liten öppning (pinhole) i ljusstrålen. Fokusera provets ljus på nålhålet, samla och spela in det överförda ljuset.
Eftersom diffraktionsmönstret beror på den numeriska bländaren och våglängden är det nödvändigt med nålhål. Därför, när dessa parametrar ändras måste nålhålstorleken justeras.
När objektivlinsen ändras (vanligtvis med förändring av numerisk öppning) kommer moderna konfokala skanningsmikroskop automatiskt att ändra pinhåldiametern på lämpligt sätt. Därför är pinholes vanligtvis utformade som dubbla eller flerskiktsöppningar.
I själva verket beror den lämpliga storleken på pinhålet inte bara på våglängd och numerisk öppning, utan också på den inre förstoringen av optiska element i mikroskop.
Därför är det inte bara oönskat utan också fel att direkt jämföra pinhåldiametrar i mikroskop med olika mönster. Om pinhåldiametern inte är inställd på det optimala värdet kommer systemet inte att kunna utföra optisk skivning smidigt (det vill säga sända defokus oskärpa) eller avbryta intensiteten onödigt utan att få ytterligare optisk skivkvalitet (vilket resulterar i onödiga brusbilder).
Bild 3: Detektion i konfokal avbildning. Ljuset från provet S är inriktat på observationspinhålet (PO) och sedan på detektorn de.
Optisk väg för konfokal skanning
Den konfokala strålbanan i konfokalt skanningssystem är bara kombinationen av punktkällbelysning och punktdetektering. Denna kombination kan användas som en optisk kniv. Endast fotoner från fokalplanet kan överföras till sensorn. Medan alla fotoner från andra platser filtreras bort. Optisk skivning realiseras med "rumsfilter".
Eftersom endast en plats visas "konfokal" avbildning vid en given tid, behövs en skanningsanordning för att flytta platsen på objektfältet i ett rutläge. Vanligtvis installeras den optiska spegeln på skanningsmotorn och används för att utföra skanningsproceduren. Det finns en flaskhals i den tid som krävs för att skanna en full ram (vanligtvis) 1 024 rader. Förbättringar har uppnåtts genom att införa en höghastighetsskanner (resonansskanner) som skannar 8, 000 eller fler rader per sekund.
Endast under mikroskoptekniken för reflekterat ljus kan en bra optisk skiva uppnås. Detta är en av orsakerna till den kraftfulla utvecklingen av fluorescensmikroskopi under de senaste 20 åren (andra skäl inkluderar uppfinningen av immunfärgning, DNA-hybridisering, fluorescerande biosensor, kvantprickar och fluorescerande protein).
Bild 4: Från vänster till höger: 1. Illuminationskonen lockar inte bara fluorescerande färgämne i fokalplanet, utan lockar också det upp och ner. Här representeras av en grön dubbel kon. 2. Emissionspinhålet avlyssnar effektivt ljuset som släpps ut ovanför fokalplanet. 3. Dessutom kommer ljuset under fokalplanet inte att passera genom nålhålet. 4. I det konfokala systemet kommer endast ljuset från provet att nå detektorn. Att upptäcka pinholes kommer effektivt att avvisa alla ljus från andra områden. Slutligen erhålls det verkliga optiska avsnittet.
